什么是细胞培养​：​基础知识、设备、基本原理

从建立细胞培养实验室到了解细胞培养基本原理和基本技术，您将在这里找到细胞培养所涉及内容的基本概述。这是进入细胞生物学世界的很好的起点。

什么是细胞培养？

细胞培养是指从动物或植物中提取细胞，然后在人工环境中进行培养以进行科学研究。最早的细胞培养技术是在100多年前开发的，为科学的巨大突破做出了贡献。如今，它已成为全世界实验室用于研究细胞的生理学、生物化学、疾病潜在机制以及药物和有毒化合物的作用的基本工具。它也可用于在药物筛选和大规模制造生物化合物，诸如疫苗和治疗性蛋白质。

细胞培养所需的基本设备和试剂

要进行需要细胞培养工作的研究并进行基本的细胞培养方案，下表1和表2汇总了一些关键设备和一些基本试剂。

表1：细胞培养所需的基本设备。

其他设备包括在层流罩中的抽吸泵，可轻松地从细胞培养容器中去除培养基和试剂；用于对设备和可重复使用玻璃器皿进行消毒的高压灭菌器；注射器，针头和镊子；计时器 、75％乙醇喷雾瓶和纸巾卷，用于对表面和设备进行消毒；胶带和用于标记的永久性标记记号笔；管架和废物箱等。

表2：细胞培养所需的基本试剂。

细胞培养实验室设计

任何细胞培养都需要几个重要的注意事项。最重要的方面是维持无菌和无菌环境，以防止细胞污染。首先，应使用一个单独的封闭房间或带有一个进出点的实验室。应在实验室入口和出口附近设置带有肥皂和消毒剂的洗手水槽，以进行手部清洁。专用细胞培养实验室外套和安全镜应放在实验室入口处。层流罩和培养箱应远离入口，以最大程度地减少污染风险。将通风橱和培养箱放置在远离任何空调单元的位置，以防止可能被污染的气流进入无菌工作环境和培养箱中，这一点也很重要。应该有足够的清洁工作表面，需要定期进行消毒，并要有足够的存储空间，以确保工作表面保持清洁。实验室内所有必要的设备和消耗品均应可触及，以防止退出和再次进入。人体工程学环境对于层流罩非常重要，因为层流罩在工作时应有足够的空间放置物品或可移动的消耗品推车，并且易于接近培养箱，显微镜和离心机。

细胞培养安全

细胞培养实验室会带来处理和操纵细胞和组织以及有毒，腐蚀性或诱变性溶剂和试剂有关的风险。因此，遵守标准的微生物实践和技术对于降低风险和确保安全至关重要。生物安全有四个级别，称为生物安全级别（BSL）。每个级别都有相应的微生物标准、安全设备和设施防护措施，在处理有害生物材料和有害物质时应予以实施。BSL-1是大多数研究和临床实验室所共有的基本保护水平，在这些实验室中，所使用的药物尚无法在正常健康的人类中引起疾病。BSL-2适用于已知中度风险的药物，已知这些中度风险的药物通过摄入或经皮或粘膜暴露可导致严重程度不同的人类疾病。大多数细胞培养实验室应至少为BSL-2，但具体要求取决于所用生物材料和所进行工作的类型。造成严重且可能致命感染的细胞或试剂需要BSL-3，而BSL-4实验室则需要密闭程度最高。

以下是细胞培养实验室的基本安全建议列表。清单不完整，应补充适当的生物安全水平建议。

• 始终穿戴适当的个人防护设备（PPE），包括实验室外套，手套和护目镜。

• 务必阅读所使用的任何物质的材料安全数据表（MSDS），以确保在处理时采

• 适当的安全预防措施。

• 在实验之前和之后对所有工作表面进行消毒。

• 即使没有受到污染，也应定期清洁实验室设备。

• 避免产生气溶胶或飞溅物。

• 在使用有潜在危险的材料之后以及离开实验室之前，请洗手。

• 在处置之前，对所有潜在的传染性材料进行消毒。

• 将可能导致传染性物质暴露的任何事件报告给适当的人员（例如，实验室主管，安全员）。

• 请勿在实验室中饮食，抽烟，吸烟，戴隐形眼镜，涂抹化妆品或存放食物以供人类食用。

细胞培养基础

培养条件

对于细胞存活和生长，至关重要的是培养环境尽可能复制细胞的生理环境。可以控制的培养条件包括温度、相对湿度和二氧化碳含量，以及与培养基相关的因素，例如营养成分、pH、分子渗透摩尔浓度以及补料的体积和使用频率。这些变量会随时间波动，因此应对其 进行监视。下表3突出显示了大多数哺乳动物细胞培养的最佳培养条件，但有些细胞确实存在例外。

表3：大多数哺乳动物细胞的最佳细胞培养条件。

原代细胞与永生细胞

原代细胞培养是直接从完整或分离的组织或器官片段中分离并在培养皿中生长的细胞。首次将原代培养物进行传代培养后，它就被称为细胞系。原代细胞系的寿命有限，在达到衰老状态（细胞分裂停止）之前只能传代培养10至20次。

一些细胞系的寿命没有限制，并且具有无限的增殖能力。这些细胞系被称为连续的或永生的细胞系。细胞的永生化可以多种方式发生。癌细胞具有固有的突变，使细胞能够不受限制地繁殖。最初具有有限寿命的正常细胞可以通过促进生长的基因突变而转化为永生化细胞。通过化学处理或引入可激活生长促进基因的致瘤病毒，也可使在培养物中生长的正常细胞永生。下图1显示了从原代到转化后连续细胞系的进化以及每个阶段的理论细胞产量。

图1：原代细胞到连续细胞系的进化和理论细胞产量。

贴壁培养与悬浮培养

贴壁细胞附着于细胞培养容器表面，进行单层细胞生长。传代时，需要使用剥离剂将其从表面剥离。传代后几个小时内，它们会重新附着在表面上。悬浮细胞不会在细胞培养容器的表面形成单层，而是保持悬浮状态。细胞可能会形成团块，尤其是高密度时。

哺乳动物与非哺乳动物细胞培养

哺乳动物细胞培养是最常见的，但是，可以培养的细胞来自多种生物细胞，例如植物，昆虫，细菌和酵母。植物细胞培养物通常在液体培养基中作为细胞悬浮培养物或在固体培养基中作为愈伤组织培养物生长。源自果蝇（Drosophila melanogaster）或粘虫（Spodoptera frugiperda）的细胞是昆虫细胞系的典型实例，其分别用于生化测定或重组蛋白的表达。对于细菌和酵母菌，通常会在含有嵌入营养物的固体支持物（通常是凝胶，如琼脂）上培养少量细胞，细胞悬浮培养需要在营养培养基的条件下进行大规模培养。

细胞生长与融合

细胞培养物的生长通常分为四个阶段（如下图2）。当细胞适应培养条件且未分裂时，就会发生滞后阶段。对数阶段发生在细胞生长活跃分裂时。这是细胞实验和数据收集的最佳阶段。当细胞达到对数后期时，应进行传代培养。这是在“人满为患”之前发生的。当细胞接近拥挤时，细胞生长会减慢。这被称为固定相或平稳期。此阶段的细胞处于细胞应激的风险中。当细胞死亡的自然过程占主导地位时，细胞群被认为处于死亡阶段，也称为衰退阶段。当绘制细胞计数随时间变化的对数图时，它会产生一个S型曲线，如下图2所示。

图2：细胞生长的四个阶段。

描述单层细胞培养的重要指标是融合。当通过显微镜观察时，是指被细胞层覆盖的培养容器表面积的百分比。例如，当培养皿的表面积的一半被细胞覆盖时，该群体被认为处于50％汇合。下图3中的示意图显示了不同细胞融合的示例。细胞密度用于描述在悬浮液中生长的细胞。

图3：示意图显示了在显微镜下以20％，50％，80％和100％融合状态下表示的细胞的4个视野。

细胞系选择

世界各地的实验室中使用了成千上万种成熟细胞系，可以从商业或非营利性供应商（细胞库）购买。从经过验证的细胞库无污染的角度出发，从信誉良好的供应商那里获得细胞系至关重要。从其他实验室获得细胞系具有很高的污染风险，并且缺乏细胞系验证，因此建议您不要这样做。

选择合适的实验细胞系时，应考虑下表4中的标准。选择的细胞系将在很大程度上取决于要进行的实验的性质和要求。

表4：选择细胞系时要考虑的标准。

下表5列出了20种常用细胞系及其特征，包括种类，组织起源和形态。通常将细胞的形态描述为成纤维细胞，上皮细胞或淋巴母细胞，它们既表明细胞的来源，也表明其物理外观。成纤维细胞是双极或多极的，并且形状细长。上皮细胞具有多边形形状，通常显示出更规则的尺寸，而淋巴母细胞显示出球形轮廓，通常在悬浮液中生长。

表5：常用的细胞系和它们的特征。

细胞系认证

细胞培养是世界各地实验室中的重要工具。但是，细胞系可能会被错误地识别或被其他细胞污染。这使发布的实验数据无效，并浪费了实验室时间和资源。由于此问题的严重性以及需要确保有效和可重复的结果的需要，期刊，机构和资助机构现在建议或要求进行细胞系鉴定。可以通过使用短串联重复序列(short tandem repeat, STR)基因进行基因分析来实现细胞系认证。细胞应在收到新细胞系后进行鉴定，并在传代培养中定期进行鉴定。

细胞培养基：选择适合细胞的培养基

培养的细胞用液体培养基培养。下表6中详细列出了构成细胞培养基时要考虑的四个关键因素。有关细胞培养基需求的具体细节，请参见数据表。培养新细胞系时，务必确保检查数据表中有关培养条件的详细信息。

表6：哺乳动物细胞培养基的关键成分。

标准细胞培养方案

在所有细胞培养实验室中都有几种基本的细胞培养方案。熟悉并理解这些操作标准（SOP）很重要。

无菌技术

始终如一地进行无菌技术的操作可以帮助确保所有培养基和培养皿的无菌性，从而减少细胞暴露于污染物的机会，并保持培养物健康，可行和纯净。严格的无菌技术是成功进行细胞培养以使培养物免受微生物污染和细胞交叉污染的必不可少的先决条件。无菌技术操作盖，试剂和工作场所如下表7所示。

表7： 处理细胞培养时所需的无菌技术的摘要。

原代细胞分离

原代细胞分离可以在多种复杂的生物学样品上进行，包括组织（皮肤，肝脏，肿瘤，脑，肺等），骨髓，血液，脾脏和淋巴结。有许多不同的方法可以制备样品以获得最佳的细胞分离效果。选择的方法取决于您的起始样品，可能涉及从样品中除去某些元素或仅创建单细胞悬液。从完整组织中分离细胞时，必须首先使用机械力或蛋白水解酶破坏将细胞固定在一起的细胞外基质（如下表8）。

表8：组织解离方案中通常用于细胞分离的酶。

原代细胞分离的基本原理要求将分离出的组织切碎或用无菌剪刀或手术刀切成2-4毫米的碎片。将薄纸片加上适当的缓冲液或平衡盐溶液中，洗涤2-3次。根据方案添加解离酶并孵育。通过轻轻移液将细胞分散。通过细筛过滤细胞悬浮液，并洗涤2-3次。将细胞重悬于培养基中并接种。

传代细胞

传代培养或传代是指稀释已达到高度融合的细胞以使其能够连续培养。贴壁细胞在80-90％汇合时应传代，悬浮细胞应在细胞结块且混浊时传代。记录每个细胞系的细胞传代数非常重要。这有助于监视原细胞活力并在其达到衰老之前计划实验。随着传代次数越高，遗传漂移越远，它有助于监测永生细胞的年龄。不应对传代数很高的细胞系进行实验。

始终轻柔地处理细胞非常重要，因为剧烈或严厉的处理可能会导致细胞损坏或死亡。切勿用移液器直接吸取培养基或将缓冲液直接洗涤到细胞上，请始终将其轻轻地添加到容器侧面，以免损坏细胞。当重悬沉淀或研磨混合细胞时，请轻柔地进行。

简而言之，贴壁细胞的传代培养方案如下：去除培养基，并用PBS洗涤细胞一次。加入分离剂，例如胰蛋白酶（分解使细胞粘附到血管上的蛋白质），然后将细胞在37°C下温育直至完全分离。分离可能需要1-20分钟，具体时间取决于细胞系。在显微镜下监控细胞，以确定何时发生分离。通过向细胞中添加完整的培养基使胰蛋白酶失活（血清中的胰蛋白酶含有蛋白酶抑制剂使胰蛋白酶失活），然后在离心机中离心（150–300g，3-5分钟）使细胞沉淀。除去培养基（沉淀上部的液体），将细胞轻轻重悬在新鲜培养基中，然后将细胞以所需密度铺在新的培养皿中。对于悬浮细胞，不需要胰蛋白酶。收集细胞并离心（在150–300g下离心3-5分钟）形成沉淀，除去培养基，将细胞重悬于PBS中进行洗涤。在另一轮离心后除去缓冲液，将细胞重悬于新鲜培养基中，并以所需密度重新接种。

冷冻保存和复苏

细胞系是宝贵的资源，因此保存库存以进行长期存储至关重要。冷冻保存是指在非常低的温度下冷却和保存细胞以保持其生存能力的过程。细胞库适合在低于-130°C的温度下长期保存。

冷冻保存培养细胞的最佳方法是在冷冻保护剂（例如DMSO）存在的情况下，将它们保存在完全培养基中的液氮中。防冻剂降低培养基的凝固点，还可以降低冷却速度，从而大大降低形成冰晶的风险，而冰晶可能损坏细胞并导致细胞死亡。细胞应以高浓度（例如90％融合时）和最早的传代次数进行冷冻保存。简而言之，冷冻保存包括洗涤和沉淀细胞，将其重悬于含有DMSO（例如5％DMSO）的完全培养基中，并将细胞悬浮液转移至1mL无菌冷冻管中。由于细胞必须缓慢冷冻，因此将冷冻管放置在可控速率的冷冻室或冷冻室中。将冷冻冷冻的容器在-50至-80°C的温度下储存24小时，然后将冷冻管转移到液氮储存器中。

确切的冷冻条件取决于使用的细胞系。检查特定于细胞系的条件非常重要，否则冷冻的种子细胞在复苏和再培养时可能不会产生活细胞。

为了从液氮储存中恢复细胞系，将冷冻的小瓶在便携式液氮容器或干冰中运输到细胞培养区域。冷冻小管中的DMSO一旦融化，会对细胞产生毒性，因此，为确保高细胞活力，必须在37°C水浴中迅速融化细胞，并立即将其转移到装有预热培养基的培养皿中。培养基稀释了DMSO，因此细胞不再处于有毒浓度。一旦复苏的细胞繁殖并传代两次，它们就可以用于实验。比较好的作法是尽快冷冻储存更多细胞，并更换长期存储的细胞。

测试细胞支原体感染

细胞培养中的主要问题是支原体感染。这种细菌感染会改变细胞行为和新陈代谢，并对细胞产生不利影响。定期执行支原体检测测定非常重要，尤其是对于连续细胞系。较好的作法是在冻存之前，当收到新的细胞系，将原细胞种子复苏和培养后，进行支原体测试。培养细胞需要6周。一种简单而可靠的支原体检测方法是用Hoechst 33258（一种特异性结合DNA的荧光染料）对细胞样品染色，并在荧光显微镜下观察。不含支原体的细胞显示清晰，干净的核Hoechst染色，而感染支原体的细胞也显示出在细胞核之外的细菌DNA的丝状染色模式（如下图4）。

图4：示意图显示未染色的细胞（上部）和被Hoechst 33258染色的细胞，细胞未受支原体污染（左下）而受支原体污染（右下）。未污染的细胞培养物显示细胞核染色，而未污染的细胞培养物显示细胞核染色和细胞质染色。细胞质染色表明存在支原体细菌DNA。

细胞计数

尽管最近出现了自动细胞计数器的发展，但使用血细胞计数器进行手动细胞计数仍是最常用的方法。血细胞计数仪由厚的玻璃显微镜载玻片和两个刻有蚀刻垂直线的栅格组成，形成腔室。还提供了薄玻璃罩。使用前，请务必清洁血细胞计数器和盖玻片，并将盖玻片放置在腔室上方。在盖玻片下方的显微镜载玻片的两个小室之一中加入10 – 20μl细胞悬液。使用反相显微镜在20倍放大率下对四个外部正方形的每个单元格进行计数，如下图5所示。目标是计数每平方100-200格可获得准确结果。如果您的细胞太少，则下次用较少的培养基重悬细胞。如果要计数的细胞太多，则将细胞重悬于大量的培养基中。计数完每个角后，将计数加在一起并除以四。您的细胞浓度将是您的计数x10⁴细胞/mL。要计算总细胞数，将浓度乘以细胞悬液体积。例如，浓度为80x10⁴个细胞/mL的5mL细胞悬液总计为400x10⁴个细胞或4x10⁶个细胞或400万个细胞。

图5：用血细胞计数器计数细胞。顶面板显示了血细胞计数器的俯视图和侧视图。左下方的面板显示了在显微镜下计数室的外观。黄色框突出显示要计数的象限。右下方的面板是一个如何计算一个象限中的示例。

细胞转染

细胞转染术语是指将核酸（DNA或RNA）递送到培养的细胞中。最常用的试剂是阳离子脂质，可以与核酸结合形成带正电荷的复合物，并使DNA/ NA与带负电荷的细胞膜相互作用。这导致核酸通过内吞作用有效进入细胞。这通常称为脂质转染。或者，可通过电穿孔，DNA与磷酸钙的共沉淀或聚乙烯/DMSO震荡将核酸递送到细胞中。递送的DNA通常不整合在宿主基因组内，因此是瞬时的。为了实现基因的稳定表达，可以设计稳定的细胞系。

脂质转染转染方案非常简单。本质上，制备了包含合适浓度的DNA/RNA的溶液用于转染，并制备了包含脂质转染试剂的溶液。将两种溶液混合在一起，并根据实验方案孵育一段时间。然后将该溶液加入到60-80％融合细胞，实验可以作为转染后6个小时来进行。瞬时转染通常持续长达72小时。